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64 A B C CIENCIA Y FUTURO MIÉRCOLES 28- 10- 87 Cl Escribía la pasada semana sobre la satisfacción que puede producir el dedicar la vida a ¡a investigación científica y, en concreto, me refería a la etapa investigadora de mi laboratorio en relación con la fijación de CO, por animales y plantas. Hoy voy a continuar en esta línea, pero voy a describir las distintas etapas que cubrí sobre la polinuTambién pensé que habría más posibilidades de encontrar estos enzimas en extractos de la bacteria azotobacter vinelandii, que tenían la capacidad de oxidar muy activamente glucosa, piruvato y otros compuestos intermediarios del ciclo del ácido cítrico Acababan de llegar al laboratorio dos estudiantes posdoctorales: Ernie Rose, procedente de la Universidad de Chicago, y Marianne Grunberg- Manago, del Instituto de Biología Físico- Química (Fundación Rothschild) de París. Otro de los problemas que me interesaba en aquella época era el mecanismo de la fosforilación del acetato a acetilfosfato por un enzima bacteriano. Expliqué los dos proyectos a los nuevos colaboradores y les pedí me dijeran en cuál de ellos preferían trabajar. No lo pensaron mucho: Bernie escogió el acetilfosfaío, y Marianne, la fosforilación oxidativa. Los extractos de Azotobacter parecían promover muy activamente la incorporación de fosfato marcado con 32 P en ATP y purificamos parcialmente la proteína o proteínas que catalizaban dicha incorporación. En aquel tiempo, la mayoría de los productos utilizados en la investigación bioquímica podían ya obtenerse comercialmente. Comenzamos usando un preparado amorfo de ATP, el más puro que había entonces en el mercado; pero, al mes o dos de haber comenzado el trabajo, apareció un preparado cristalino y, como era de esperar que fuese más puro, decidimos utilizarlo. Sin embargo, con el ATP cristalino no había reacción alguna. De momento, esto nos alegró, pues pensamos que el ATP menos puro podía contener un coenzima, hasta entonces desconocido, necesario para la reacción, pero no fue así. Cuando analizamos nuestro ATP amorfo, en busca del nuevo coenzima, encontramos que el ATP estaba contaminado solamente por una pequeña cantidad de ADP (producto de su hidrólisis) y que, cuando la incubación se hacía con ADP en vez de ATP, el ADP incorporaba fosfato radiactivo. Esto nos desanimó de momento; indudablemente, este fenómeno no podía tener relación con la fosforilacleótido- fosforilasa y la clave genética. En 1945, unos diez años después de mi último trabajo sobre fosforilación oxidativa, me pareció, un tanto ingenuamente, que era hora de volver sobre este tema. enzima participase en la síntesis Pensé que debía buscar enzimas capaces de convertir ADP a ATP, y para ello había que determinar biológica del RNA, sino que más la incorporación de fosfato radiactivo en el ATP. bien podría funcionar en la degradación del mismo. Aún no se sabe si esto es así. ción oxidativa, pero, al fin y al cabo, da de diálisis exhaustiva contra Poco después se encontró en vanadie había demostrado la existen- agua destilada y liofilización. Como rios laboratorios, incluyendo el cia de una incorporación enzimática la presencia de GDP enlentece la nuestro, un enzima, la RNA polimede radiofosfato en ADP en las con- reacción, para preparar polímeros rasa, que, utilizando una de las cadiciones usadas por nosotros. Sin conteniendo GPM disminuimos la denas del DNA como molde o duda, teníamos una nueva reacción concentración de GDP relativa a la guión, copia su secuencia de bases, entre las manos. Pronto encontra- de los otros nucleósido- difosfatos y dando lugar a la formación del llamos que la incorporación de radio- aumentamos fuertemente la canti- mado RNA mensajero, que, a su fosfato ocurría no sólo cuando el dad de enzima. Más adelante ob- vez, actúa de molde en la síntesis preparado de Azotobacter se incu- servamos que algunos oligonucleóti- de proteínas de tal modo que éstas baba con ADP, sino también cuan- dos pueden actuar como iniciadores tienen una secuencia dé aminoácido se i n c u b a b a con otros de la reacción con GDP y aumentan dos determinada por la secuencia nucleósido- difosfatos, tales como el considerablemente la síntesis de de bases del DNA. Así se expresa UDP, el CPD, el GDP y el IDP. polinucleótidos que contienen resi- en los seres vivos la información Durante varias semanas tratamos duos de GMP. genética contenida en el DNA. El de demostrar formación de AMP a paso DNA- RNA mensajero se copartir de ADP en presencia del enzinoce como transcripción; el de RNA Estructura idéntica ma de Azotobacter. Eventualmente mensajero- proteíñas, como traducnos dimos cuenta de que el ADP se Con la colaboración de Warner ción del mensaje genético. convertía en un polímero de eleva- (N. Y. University) y la de L. Heppel, La importancia de la do peso molecular con liberación de R. Hillmoe y M. Singer (NIH) esta- polinucleótido- fosforilasa estriba en ortofosfato. blecimos que con una mezcla de el hecho que permite sintetizar una Este potímero era un ácido polia- nucleósido- difosfatos, correspon- gran variedad de ribopolinucleótidos denílico constituido por un gran nú- dientes a los residuos nucleotídicos que han servido de modelo para el mero de residuos de AMP; lo deno- que se encuentran en el RNA natu- estudio de ciertas propiedades funminamos poli (A) Incubamos ADP ral, la polinucleótido- fosforiiasa cata- damentales de los ácidos nucleicos con enzima parcialmente purificado, liza la síntesis de polinucleótidos y, sobre todo, en el uso que en en presencia de iones Mg, y dete- muy semejantes al RNA. nuestro laboratorio y en el de Marsníamos la reacción por desproteinización con ácido tricloroacético. Pensando que ADP se hidrolizaba a AMP (un compuesto ácido soluble) al separar la fracción soluble del precipitado proteico por centrifugación, buscábamos AMP en la fracción soluble, pero nunca lo encontramos; en vez de ello, vimos que se formaba un polímero insoluble en ácido tricioroacético que se encontraba, por consiguiente, en el precipitado. Disolviendo el precipitado en agua, el polímero precipitaba por la adición de etanol. Fácil es imaginar mi emoción cuando me di cuenta de lo que realmente ocurría. Un polímero de alio peso molecular, análogo al RNA, había sido sintetizado por primera vez fuera de la célula mediante una reacción enzimática. Se incubó enzima de Azotobacter con diversos nucleósido difosfatos, o con mezclas de varios de ellos, determinando el progreso de la reacción por la liberación de ortofosfato. En todos los casos se continuó la incubación hasta que la reacción alcanzaba el equilibrio, lo que sucedió entre las cuarenta y cuarenta y seis horas. Los polinucleótidos se aislaron por precipitación con etanol, segui- Un polímero de alto peso moiécular, análogo al RNA, había sido sintetizado por primera vez fuera de la célula mediante una reacción enzimática La polinucleótido- fosforilasa desempeñó en el desciframiento de la clave genética un papel semejante al que la famosa Piedra de Rosetta jugó en el de los jeroglíficos egipcios por Champolion La estructura de estos polímeros es idéntica a la del RNA, pero, mientras que los nucleótidos en el RNA natural están eslabonados en un orden característico de cada RNA, en los sintetizados por la polinucleótido- fosforilasa están eslabonados al azar. Con M. Stahelin y D. Brummond observamos que la polinucleótidofosforilasa está ampliamente distribuida en las bacterias, pero sólo la encontramos excepcionalmente, y en muy débiles cantidades, en tejidos animales. No parecía, por tanto, que este hall Nirenberg (NIH) se hizo de este enzima para descifrar la clave genét i c a Puede p e n s a r s e que la polinucleótido- fosforilasa desempeñó en este desciframiento un papel semejante al que la famosa Piedra de Rosetta jugó en el de los jeroglíficos egipcios por Champolion. En 1960 se suponía, por consideraciones teóricas y, sobre todo, por ingeniosos experimentos genéticos de Francis Crick y sus colaboradores, que cada tres bases consecutivas del RNA mensajero (mRNA) especificaban un aminoácido. Por otra parte, Nirenberg y otros